Her Beyini Eşsiz Yapan Nedir?

Kalıtım yoluyla aldığımız genler ve çevresel faktörlerin her ikisi de insan davranışlarını etkilerler. Bilimadamları, yakın bir zamanda geçerli diğer temel işlemleri keşfettiler.beyni_essiz_yapan

Genom’da yeni yerlere kendilerini kopyalayabilen ve yapıştırabilen SIÇRAYAN GENLER adlı DNA parçaları; tam-boy genleri değiştirebilirler. Bu yerlerdeki bitişik genleri bazen etkinleştirirler.

Bu aktivite; yakın akraba bireylerde bile farklı karakter ve davranışlara yol açarak, beyinde diğer bölgelerden daha fazla meydana gelir.  Bu akışkan genetik elementler, insanların psikiyatrik rahatsızlıklara olan eğiliminde de rol oynayabilirler.

 Araştırmacılar şimdi, sıçrayan genlerin hızla değişen çevresel şartlara uymak için bizlere yardımcı olup olmadıklarını araştırmaya başlıyorlar.

BEYNİNİZ ÖZELDİR.
Benimki de öyledir. Farklılıklar, organın her seviyesindeki şaşılacak derecede karmaşık yapısında ortaya çıkmaktadırlar. İnsan beyni, binlerce türde olan ve yaklaşık 100 trilyondan fazla arabağlantıyı topluca oluşturan 100 milyar nöronu kapsamaktadır. Dolayısıyla; bu farklılıklar düşünme, öğrenme ve davranma biçimlerimizde ve zihinsel hastalıklara olan eğilimimizde farklılıklara yol açmaktadırlar.

Beyindeki telleme ve fonksiyon farklılığı nasıl meydana gelir?  Anne-babamızdan bize miras kalan genlerdeki farklılıklar rol oynayabilirler.  Gerçi; aynı anne-babadan yetişmiş tek yumurta ikizleri bile zihinsel fonksiyonlarında, davranışsal kişisel özelliklerinde ve zihinsel hastalık veya nörodejeneratif hastalık riskinde önemli derecede farklı olabilirler. Aslına bakarsak, genetik olarak birbirinin aynı geliştirilmiş fareler yaş, cinsiyet ve bakımları sabit olsa bile; öğrenme kabiliyeti, korkuyu önleme ve strese yanıt verme durumu laboratuvar sunu farklılıklarında tamamen aynı şekilde üstesinden geldiler.  Bundan daha fazlası olmalıydı.

Kuşkusuz, yaşam konusundaki deneyimlerimiz de onu yapabilir; örneğin, nöronların belirli topluluğu arasındaki bağlantıların gücünü etkileyebilirler. Fakat araştırmacılar diğer faktörlerin de işlediğinin kışkırtıcı belirtilerini artan bir şekilde keşfediyorlar; örneğin, genleri mutasyona uğratan süreçleri veya embriyonun önceki gelişimindeki veya daha sonraki yaşamındaki etkiyi.  Böyle bir fenomen, tek bir genin iki veya daha fazla farklı protein verebildiği alternatif birleştirmeyi de kapsamaktadır.

Proteinler, hücrelerdeki işlemlerin büyük çoğunluğunu gerçekleştirirler ve böylelikle; hücrelerde yapılan proteinler o hücrelerin oluşturduğu dokuların işlevini etkileyeceklerdir. Birçok araştırmacı; epigenetik değişimlerin, gen aktivitesini değiştiren DNA değişikliklerinin rolünü belirli proteinlerin sentezini arttırarak veya azaltarak genlerdeki bilgiyi değiştirmeden araştırıyorlar.

Geçen birkaç yıl içerisinde ikimiz ve çalışma arkadaşlarımız diğer dokulardan ziyade beyini daha fazla etkiliyor gözüken, bilhassa merak uyandıran şüpheli şeylere rastladı: SIÇRAYAN GENLERE. İnsanlar dahil, tüm türlerde keşfedilen böyle genler; kendilerindeki kopyaları genom’un (çekirdekteki DNA’nın tam takımı) diğer kısımlarına yapıştırabilirler ve onun, yanındaki aynı farklı hücreden farklı şekilde davranmasını sağlayarak, etkilenmiş hücrenin işlevini değiştirebilirler. Birçok farklı hücredeki bunun gibi birçok eklentilerin kavramsal yetenekler, kişisel karakterler ve nörolojik problemlere olan yatkınlıkta ince zekâyı yansıtanı ya da çok yansıtmayanı açığa vurması beklenirdi.

Beyindeki gen sıçramasının erken bulguları bizi bir diğer soruya yönlendirdi: Beynin doğru çalışması hayatta kalmak için birinci derecede önemliyse; neden evrim genetik programlamaya inat etmek için denemeler yaparak bir sonuca varmaya çalışanların işlem yapmasına izin vermiştir?  Kesin cevabı hâlâ bilmesek de; dayanak kanıt, beyin hücrelerindeki değişkenliği tetikleyerek sıçrayan genlerin değişen şartlara hızlı bir şekilde uymak için elastikiyetle organizmaları telkin edebileceğini ileri sürüyor. Dolayısıyla; bu sıçrayan genler veya hareketli elementler diye adlandırılanlar evrimsel olarak muhafaza edilmiş olabilirler, çünkü türlerin hayatta kalmasını destekleyen bakış açısından, bu adaptasyonun faydası risklerden daha ağır basabilir.

Eski İstilacılar

Hareketli elementlerin varolduğu ve genom’da dolanıp durdukları fikri yeni değildir, fakat beyinde çok aktif olduklarının yakın zamandaki kanıtı sürpriz oldu.  Gen sıçraması, James Watson ve Francis Crick’in 1953’te DNA’nın çift sarmalsı yapısını hecelemesinden önce bile ilk olarak bitkilerde keşfedilmiştir.1940larda Cold Spring Harbor Laboratuar’ından Barbara McClintock “denetleyici elementlerin” mısır bitkilerinin genetik materyalinde bir yerden bir yere hareket ettiklerini gözlemledi.

Stres altında genom’daki belirli bölgelerin taşınabildiğini ve yeni yerlerindeki genleri etkinleştirip devre dışı bıraktıklarını keşfetti. McCintock’ın deneylerinin neticeleri şimdinin ünlü farklılaşan renk tohumlu mısır kulaklarıydı; belirli bir hücrede farklı şekilde birbiriyle aynı olan bitişik genlerden farklılık gösteren genlerin bir modelde devreye sokulup, devreden çıktığı genetik mozaikizm’in bir gösterisiydi.

Bilimsel çevrede ilk başlarda şüpheli tavırla karşılanan McClintock’ın araştırması, en sonunda 1983’te Nobel ödülünü almasıyla sonuçlandı. Daha sonraki yıllarda genetik mozaikizm fenomeninin bitkilerle sınırlı olmadığı; insanlar dahil, birçok organizmada da meydana geldiği netlik kazandı.

McClintock, çalışmasını hücrenin genom’u etrafındaki elastikiyeti kaldırmak için kesme ve yapıştırma mekanizması kullanan akışkan elementler olan transpozonlar üzerinde yaptı. Beyindeki akışkan
elementler üzerindeki daha yakın zamandaki çalışma, genom’un yeni bölgelerine sızmak için kopya ve yapıştırma yolunu kullanan retrotranspozonlar üzerine odaklanmıştır. Kopya başka bir yerde yeni bir pozisyon aldıktan sonra çevreleyen DNA’dan fırlamanın yerine, aslında kendilerinin kopyasını yaparlar.

Retrotranspozonlar insan genom’unda nükleotitlerin ya da DNA yapı taşlarının yarısı kadarını oluştururlar. Aksine; sahip olduğumuz yaklaşık 25,000 protein-kodlama geni, memeli DNA’sının yüzde 2’den azını oluşturur.  Sıçrayan genler, uzun zaman önce ökaryot’ların (çekirdeği içeren hücrelere sahip organizmalar) genom’larını istila eden ilk ilkel moleküler kopyalayan çoğaltma sistemlerinin neslindendi. Pennsylvania Üniversitesi’nde Haig H. Kazazian Jr.’ın öncülük ettiği bir grup, 1988’de bir zamanlar fonksiyonu olmayan çöplük DNA olarak düşünülen retrotranspozon’ların insan dokularında aktif olduklarını kanıtladı.

Retrotranspozon’un özellikle aralara serpiştirilmiş element 1 (L1) olarak uzun zamandan beri bilinen bir türü, insan genom’unda anahtar bir oyuncu olarak gözükmektedir.  Ondan dolayı, muhtemelen çoğu kez hoplayabilmektedir; insanlardaki diğer akışkan elementlerin aksine, hücresel genom’da geniş bir alana yayılmak için kendi mekanizmasını kodlar.

Hücrelerdeki davranışının analizi; nükleer genom’daki L1’i birşey ‘zıplama işlevine’ başlamak için harekete geçirdiğinde, kendini ilk önce L1 DNA’nın bazı kısımları tarafından belirlenmiş bloklama proteinleri için şablon olarak çalıştığı çekirdekten sitoplazma’ya seyahat eden tek sarmallı RNA’ya kopya ettiğini gözler önüne sermektedir. Proteinler daha sonra hâlâ bozulmamış RNA ile moleküler bir blok oluştururlar ve tüm blok çekirdeğe yönelir. Orada proteinlerden bir tanesi, endonükleaz olarak adlandırılan bir enzim; DNA’nın belirli yerlerinde kırpma yapar.

Orjiinal L1 retrotranspozon, çift sarmallı DNA kopyasını üretmek için RNA’yı şablon olarak da kullanır ve bu kopyayı kesimin yapıldığı yer olan genom’a ekler. RNA’dan DNA’ya olan böyle ters kopya çıkarma; hastalığı bulaştırdığı hücrelerin genom’unda sabit hedefini almak için RNA genom’unun, DNA kopyasını alan HIV virüsünün yöntemi kapsamında bugün birçok insan tarafından iyi bilinmektedir.

Orijinal L1 DNA’nın kesik, işlevsel olmayan kopyalarını oluşturan retrotranspozisyon; çoğu kez gidişatını sürdürmede başarısızlığa uğrar. Bazen bu ufak parçalar (veya L1 kopyanın tümü) protein kodlu gen üzerinde hiçbir etkiye sahip değildirler.  Fakat diğer zamanlar, bir hücrenin kaderinde hem iyi hem kötü değişik sonuçları yapabilirler. Örneğin, kesebilirler ve böylece bir genin protein kodlu bölgesini değiştirebilirler. Bu manevra, bir organizmaya yardım eden veya zarar veren proteinin yeni farklı bir şeklinin oluşumuna yönlendirir. Veya bu konumlandırma, bahsi geçen proteinin yapılışını durdurabilir.

Yeni yapıştırılmış DNA, diğer durumlarda kodlanan bölgenin dışına ayrılabilir ama düzenleyici olarak (yakındaki genleri etkinleştiren bir devre anahtarı olarak) ve genin sıkma düzeyini, genden yapılan protein miktarın
ı hücre ve organizma için iyi ve kötü sonuçlarla bir defa daha değiştirir. L1 retrotranspozonları,
nöronlardaki veya beynin birçok hücresindeki pek çok yeri bağladıkları zaman veya beyin
her iki durumda da onların etkileri olmadan oluşmuş olandan çok farklı olacaktır. Böyle
bir genetik mozaikizm’in davranış, kavrama ve hastalık riskini etkileyebileceği mantıklı
görünür ve örneğin, bir kardeşe şizofren teşhisi konulduğunda aynı tek yumurta ikizinin
neden hastalığa yakalanmadan kalabileceğini açıklamaya yardımcı olabilir.

Sıçrama Nerede Meydana Gelir?

Son zamanlara kadar L1 retrotranpozisyonun farkında olan birçok araştırmacı, onun çoğunlukla üreme hücrelerinde (yumurtalıklar veya testisler) meydana geldiğini zannetti.  Birkaç ipucu L1 genlerinin somatik dokularda (cinsiyet olmayan hücreler) erken gelişim boyunca veya daha sonrasında aktif halde olduğunu ileri sürse de; bu ipuçları genellikle reddedilmişlerdir. Eğer genler sadece kendilerini çoğaltmak için varsa; bir evrimsel teorinin dediği gibi, sıçrayan genler somatik hücrelerde aktif halde kalmak için ufak bir probleme neden olurlardı, çünkü böyle hücreler bir organizmanın bir sonraki oluşumunda DNA olmazlardı. Neticede, etkilenen hücreler sahipleri ölünce ölürler.

Daha iyi tespit etme aletleri retrotranspozonların şimdi erken gelişim boyunca ve hatta daha sonraki yaşamda somatik dokuların etrafında hareket edebildiklerini gözler önüne sermiştir. Yetişkinlerdeki beyin hücrelerinin genetik kodlarının birbirleriyle tamamen aynı oldukları ve hücrelerin yaşamı için sabit kaldıklarının sürüncemede kalan dogmasına direkt itiraz olan bu olaylar, beyinde diğer dokularda olandan daha çok meydana gelmektedir.

Örneğin, La Jolla California’daki Salk Enstitüsü Biyolojik Çalışmalar laboratuarımızda retrotranspozisyon’a maruz kalmak için genetik olarak hücreleri tasarlanmış ve vücudunun herhangi bir yerindeki hücrenin genom’larına L1 elementi sokulduğunda yeşil floresan üreten bir farede gen sıçramasını monitörledik. Parlak yeşil hücreleri hipokampus (hafıza ve dikkat için önemli olan bölge) da dahil, sadece üreme hücrelerinde gözlemledik; bu da L1lerin diğer somatik dokulardan beyinde daha fazla gezindiklerini ileri sürmektedir. İlginç şekilde sıçrama, hipokampal nöronları arttıran öncül hücrelerde meydana gelmekteydi.

Öncül hücrelerin küçük bir topluluğu; tam teşekküllü organizmaların çeşitli organlarında bölünmek için ve ölen hücrelerin yerine geçmesi için ihtiyaç duyulan uzmanlaşmış hücre türlerini arttırmak için hazır bulunur. Hipokampus; yeni sinir hücrelerinin oluşumunun, nörojenez’in meydana geldiği beynin iki bölgesinden bir tanesidir. Dolayısıyla L1ler; nöronlar doğduğunda erken gelişim esnasında aktif olarak görünürler, fakat yetişkinlikte doğmaya devam eden yeni nöronların olduğu alanlardaki yetişkin beyninde de gezinebilirler.

Fare deneyleriyle bile,  retrotranspozisyon’un aslında beyinde meydana geldiğine dair daha fazla kanıt gerekliydi.  Beyin, kalp ve ciğer dokularındaki L1 elementlerinin sayısını karşılaştıran insan otopsi materyalinin bir analizine başladık. Beyin dokusunun, her bir hücre çekirdeğinde kalp veya dokularınının içerdiğinden önemli ölçüde daha fazla L1 elementini içerdiğini keşfettik.

Sıçramanın çoğu beynin gelişiminde meydana gelmiş olmalıydı, çünkü retrotranspozisyon erken çocukluktan sonra meydana gelen hücre bölünmesine, iki sınırlanmış alan haricinde beyinde meydana gelmeyen bir işleme gerek duyar. Bir analiz; insanlardaki her bir nöral hücrenin ortalama 80 L1 birleştirme olayını, hücreler arasında çok miktardaki farklılığa dahi yönlendirebilen bir oranı ve farklı kişilerin tüm beyin aktivitelerinde farklılıklara maruz kaldıklarını ileri sürdü.

Edinburgh yakınlarındaki Roslin Enstitüsü’ndeki araştırmacıların yakın zamandaki bir buluşu ve çalışma arkadaşları, insan beynindeki L1 aktivitesinin daha ileri teyitini temin ediyor. Araştırmacılar 2011’de  Nature’a L1 eklentilerinin toplam 7,743’ünün birleşik L1elementini kapsayan üç ölü bireydeki hipokampus ve kuyruklu çekirdekte (o da hafızayla ilgilidir) olduğunu bildirdiler (Scientific American, Nature Yayım Grubu’ndandır).  Çalışma ayrıca, bu araştırma ilerledikçe beyindeki genetik farklılığın yeni görülen portresinin sadece daha da karmaşık hale geleceğini gösterdi. Roslin takımı, kısa araya serpiştirilmiş elementler (SINE) olarak bilinen retrotranspozonlar sınıfının yaklaşık 15,000 üyesiyle karşılaşınca şaşırdı. Alu elementleri grubunun bir parçası olan baskın SINE’yle beyinde daha önce hiç karşılaşmamışlardı.

Bulgularımız bize L1 aktivitesini neyin tetikleyebileceğini merak ettirdi. Hipokampus’un ayrıca nörojenez’in meydana geldiği yer olduğunu,  alışılmamış durumları ortaya çıkardığını ve farelerde nörojenez’i tetiklettirdiğini bilerek alıştırmanın gen sıçraması için bir dürtü olabileceğini görmeye karar verdik. Gen aktarımlı farelerimizin tekerlekte devamlı koşturmalarından sonra, kemirgenlerin hipokampus’undaki yeşil floresan ışığı yayan hücrelerin sayısının neredeyse iki katı kadar arttığını keşfettik.  Nörojenez’i alışılmadık durum ve dürtünün harekete geçirdiğini de varsayarsak; yeni veya tanıdık olmayan bir çevrenin retrotranspozisyon’un bir diğer kışkırtıcısı olabileceği olasılığını aklımızda bulundururuz.

Eğer haklıysak ve L1 sıçraması sinir sistemi dış dünyayı öğrendikçe ve adapte oldukça artarsa, bulgu; bireysel beyinlerin ve onları oluşturan nöronal ağların durmadan değiştiklerini ve genetik olarak tek yumurta ikizi olanlarda bile her yeni deneyimle değişim geçirdiklerinin bir göstergesi olabilirdi.

Hastalığın Kaynakları

Sadece DNA’daki L1leri saymanın daha ötesine geçerek, sıçrayan genlerin beyin işleminde insan farklılığına katkıda bulunduklarının varsayımı için olan kanıtı genişletmeye devam ediyoruz. Yaşayan insanlar üzerinde ya pozitif ya da zarar verici etkilere sahip gerçek olaylar hakkındaki verimizi birleştirmek için olan araştırmamızda, sıçrayan genle meydana gelen kötü neticelerin gerçek nedenini bulmak sırf sonuçlar çok açık olduğu için bazen en kolaydır.

Kasım 2010’da takımımız; Nature dergisine beyindeki L1 retrotranspozisyonu, MeCP2 diye adlandırılan bir gendeki mutasyonun etkilediğini bildirdi. MeCP2 genindeki mutasyonlar neredeyse yalnızca kızları etkileyen beyin gelişiminin ciddi bir rahatsızlığı olan Rett sendromu’na neden olabilirler. MeCP2’nin Rett sendrom’lu hastalarda ve diğer zihinsel hastalıklarda mutasyona uğramış olmasının keşfi, bu hastalığın moleküler ve hücresel mekanizmaları hakkında birçok soruya yol açtı. Araştırmamız; Rett sendrom’lu olan fareler ve insanların beyinlerindeki mutasyonun, sıçrayan genlerin MeCP2 mutasyonunun bazı etkilerinin açıklamasını yapabilen bir bulgunun, onların nöronlarındaki L1 eklenti sayılarında kayda değer bir artış meydana getirdiğini gösterdi.

L1 aktivitesi diğer hastalıklarda da bulunmuştur. Şizofren’li kişilerin frontal korteks bölgelerindeki bir analiz; aynı durumda olmayanlarla karşılaştırılan akışkan element dizilişlerinin üretimi arttırdığını gözler önüne serdi. Ayrıntılı kanıt, otizm dahil, çeşitli beyin rahatsızlıklarının önemli bir öğesinin L1 elementleri olduğunu ileri sürmektedir. Psikiyatrik hastalıkların gelişimindeki akışkan elementlerin rolünü anlama; teşhis, tedavi ve korunmada yeni metodlara yönlendirebilir.

Beyindeki sıçrayan genlerle ilgili devam eden araştırma, tüm akademik öğretiye potansiyel olarak meydan okuyabilirdi. Davranışsal genetikçi çoğu kez tek yumurta ikizi gruplarını genlerin etkilerini kontrol etmek için ve şizofren gibi rahatsızlıklara olan çevresel katkılarını belirlemek için uzun süre boyunca izler. Sıçrayan genlerin bir embriyo oluştuktan sonra genom’ları aktif olarak değiştirdiğini gösteren yeni bulgular, ‘’tek yumurta’’ ikizlerinin genetik olarak aynı şekilde oldukları varsayımını sorgulamaktadır. Gerçeği söylemek gerekirse yeni keşifler, doğanın rölatif etkilerini ve akıllarımızı besleyen şeyi çözmeyi gitgide daha zor hale getirecekler.

Soru sürüyor: Farz edelim ki; sıçrayan genler potansiyel olarak bizi ölümcül genetik bozukluklarla tanıştırmanın büyük olasılığına sahip, neden evrim bu çok eski virüslerin kalıntılarını hücrelerimizin içinden yok etmedi?  Soruyu yanıtlamak için; insanların virüs kaynaklı parazitler ve sıçrayan DNA’yla, genom’larımızın büyüklüğünü genişleten diğer istilacılar tarafından her zaman saldırı altında olmuş olduklarını kabul etmeliyiz. İnsan vücutları ve evrimsel atalarımız başkasının işine burnunu sokanları tamamen ortadan kaldıramamış olabilirler, fakat onları mutasyona uğratan ve etkisizleştiren çeşitli akıllı mekanizmalar aracılığıyla onları susturarak en azından istilacılarla bir arada olmaya adapte oldular. Görünen o ki; genom’larımız bazı durumlarda kendi hayatta kalmamızı geliştirmek için L1retroelementlerinin genetik makinesini benimsediler, bu da hücrelerin bazen izin verebildikleri veya hatta cesaretlendirdikleri L1lerin genom’un etrafında dikkatle kontrol edilmiş durumlarda sıçramalarıdır.

Oldukça kontrol edilmiş durumlarda yetişmiş tek bir genetik yapıdan gelen farelerin; strese karşı verdikleri tepkilere geniş ölçüde farklılık gösterdikleri bulgunun yakın analizinden, neden devamlılık gösterdiklerinin ipucu çıkabilir. Gözlemlenen davranışsal farklılıklar L1 retrotranspozon eklentilerinin yerleri gözüktükçe bu değişkenliği üreten mekanizmaların raslantısal olduğuna işaret eden bir örnekte, çoğu kez popülasyonda (çan eğrisini resmedin) dağılmıştır.

Genom’daki L1lerin bir yerden bir yere nasıl taşındıklarının varsayılan raslantısal doğası;  yardımcı eklentilerden gelen yararların diğer eklentilerin zararlı sonuçlarından daha ağır basacağı umuduyla, doğal seçimin ‘yuvarlanan zar’ olabileceğine işaret etmektedir. Ve doğa; bilhassa beynin karşılaşacağı görevlere tam tamına uyan yetişkin nöronların nüfusunu arttıracaktır, en azından bazı yeni pozisyonların olasılığını arttırmak için hipokampus’un nöral öncü hücreleri üzerinde sık sık bahis oynayabilir.

Az çok benzer bir işlem; hastalık yapıcı mikropla savaşmak için en iyi şekilde donanmış olan antikorlar tam-ölçek üretim için seçildikten sonra DNA’daki bağışıklık hücrelerinin bir antikor dizilişini yapmak için kendilerini tekrar sıraladıkları zaman meydana gelir.

Senaryo inanılmaz gözükmüyor. L1-aracılı etkiler büyük olmak zorunda değiller ve davranışı etkilemek için birçok hücrede meydana gelmek zorunda değiller. Kemirgenlerde, tek bir nöronun ateşleme
örneğindeki bir değişim fark yaratmak için yeterli olabilir.

Bu fikir için daha mümkün olan doğrulama; L1 sıçrayan elementlerinin şu an insan genom’undaki aktif tek kökeninin şempanzelerden iki ayaklı insanlara olan evrimsel ayrılıktan sonra, yani yaklaşık 2,7 milyon yıl sonra, insansı atalarımızın taştan aletlerin kullanımını ilk benimsemeye başladıkları bir zamanda evrim geçirdiğinin keşfidir. O bulgu, çevre hakkındaki bilgiyi hızlı şekilde işlemden geçirebilen beyinleri oluşturmaya yardımcı olabilen L1 elementleri kavramını doğru kabul etmeye katkıda bulunuyor. L1 sıçrayan genleri, insanın evrimini geliştirmede işbirlikçi bir partner olmuş gözüküyorlar.

Çeviren: Esin Tezer
Kaynak: Scientific American Mart 2012 sayısı sayfalar: 20-25

Check Also

mars1

Peki ya Mars’a Koloni Yerleştirirsek

Yıl 2066. Güneş, kızıl gökyüzünde belli belirsiz yükseliyor, hidroponik(suda bitki yetiştirme) arazilerini aydınlatıyor. Mars’taki ilk ...